La tesi doctoral de Xavier Mulet investiga els mecanismes implicats en la resistència antibiòtica dels biofilms de Pseudomonas aeruginosa, així com la implicació de la hiperexpressió de bombes d'expulsió activa en l'aparició d'interaccions antagòniques entre diferents mecanismes de resistència durant el tractament de la infecció respiratòria crònica 

Els darrers anys, l’azitromicina ha mostrat resultats prometedors en el tractament de la infecció respiratòria crònica per Pseudomonas aeruginosa. Tot i que no presenta activitat bactericida davant aquest microorganisme en cultiu planctònic, se sap que aquest macròlid inhibeix el creixement en forma de biofilm gràcies a la seva capacitat per bloquejar o interferir el sistema de percepció de quòrum bacterià. En el transcurs de les infeccions cròniques sovint se seleccionen mutants que presenten un grau d’adaptació al nínxol ecològic i als antibiòtics, tal com escau amb el mutant nfxB, gen regulador negatiu de la bomba d’expulsió activa MexCD-OprJ.

Aquest fenotip freqüentment és aïllat en mostres respiratòries de pacients amb fibrosi quística, MPOC i bronquièctasi, i es caracteritza perquè presenta resistència als antibiòtics que poden actuar com a substrat (com ciprofloxacina, cefepima o azitromicina) i perquè presenta una marcada hipersensibilitat als antibiòtics betalactàmics no substrats de la bomba i aminoglucòsids.

Per tant, un dels principals objectius de la tesi doctoral de Francesc Xavier Mulet Aguiló ha estat esbrinar si durant l’exposició perllongada a azitromicina se seleccionen mutants nfxB tant en cultiu planctònic com en forma de biofilm. A més, s’ha avaluat l’impacte de la hiperproducció d’alginat i l’efecte de la hipermutació sobre l’efecte bactericida, sobre la dinàmica de desenvolupament de resistències a azitromicina i sobre la possible aparició de resistències creuades. També ha estat objecte d’estudi la caracterització del mutant nfxB, així com la relació entre la hiperexpressió de MexCD-OprJ (a través de la mutació al seu gen regulador nfxB), l’activitat de la cefalosporinasa cromosòmica AmpC, i les bombes d’expulsió intrínseques MexAB-OprM i MexXY-OprM.

Per dur a terme aquests objectius es varen construir mutants deficients en el gen mucA (la variant mucoide PAOMA), mutS (soca hipermutadora PAOMS) i la combinació d’ambdós (PAOMSA) mitjançant el sistema Cre-Lox. Seguidament es va procedir a avaluar el comportament del mutants en creixement en forma de biofilm quan són tractats amb diferents concentracions d’azitromicina, així com la dinàmica de desenvolupament de resistències durant alguns dies. Es caracteritzaren els mutants resistents a azitromicina, se’n va determinar el perfil de sensibilitat, es quantificà l’expressió relativa de mexD com a representant de la bomba d’expulsió activa MexCD-OprJ mitjançant PCR a temps real, i finalment se’n va seqüenciar el gen regulador nfxB revelant diverses mutacions inactivants. En resum, els resultats obtinguts per l’investigador de la UIB han permès demostrar que durant el tractament de biofilms amb azitromicina hi ha una selecció de mutants nfxB a les soques salvatges, les hiperproductores d’alginat i particularment a les soques hipermutadores.   

Seguidament es va construir el mutant nul nfxB i es va procedir a avaluar-ne les propietats biològiques, la sensibilitat al complement del sèrum humà i la taxa i freqüència de mutació en rifampicina. Finalment se’n va analitzar el transcriptoma, es va mostrar que aparentment no se sobreexpressen gens implicats en la resistència antibiòtica, exceptuant aquells que pertanyen a l’operó mexCD-oprJ.  Encara que al perfil de proteïnes fixadores de penicil·lina  no es trobaren diferencies entre el mutant nfxB i la soca de referència, l’anàlisi de proteïnes de membrana externa va revelar una disminució de l’expressió de OprM, responsable de la hipersensibilitat a aminoglucòsids i betalactàmics amb l’excepció de l’imipenem. De forma anàloga, la disminució de l’expressió de OprM no justificà la reversió del fenotip de resistència a betalactàmics en el mutant nfxB-dacB. No obstant això, la determinació fraccionada (extracte cru, periplasma i sobrenedant) de l’activitat betalactamasa específica del mutant nfxB i del mutant doble nfxB-dacB mostrà un dràstic descens de l’activitat periplasmàtica com a conseqüència de la inactivació de nfxB, a costa d’un augment de l’activitat mesurada al sobrenedant. A continuació es va avaluar si aquesta diferència resultava beneficiosa en el si d’un biofilm tractat amb antibiòtics betalactàmics, i es va demostrar que efectivament en aquest escenari el mutant nfxB té una supervivència superior a la de les seves soques parentals tant en condicions d’inducció com en condicions d’hiperproducció constitutiva per desrepressió de l’expressió de ampC, a través de la mutació a dacB.

Així, les dades obtingudes per Francesc Xavier Mulet Aguiló revelen que la hipersensibilitat a betalactàmics és deguda a la incapacitat per acumular AmpC a l’espai periplasmàtic, i que es produeix una permeabilització cap al medi extracel·lular. No obstant això una anàlisi d’aquest fenomen ens ha permès descriure com aquesta permeabilització resulta beneficiosa per a la comunitat formadora del biofilm, atès que AmpC quedaria reclòs dins la seva matriu. La posterior inactivació de nfxB en soques clíniques demostrà que aquesta troballa no és específica de la PAO1.

Finalment, les dades preliminars suggereixen que la permeabilització que experimenta AmpC al mutant nfxB ocorre també amb altres betalactamases, particularment de les classes B i D.

Fitxa de la tesi doctoral

• Títol: Caracterización del mutante nfxB de Pseudomas aeruginosa: papel en la resistència antibiòtica de los biofilms e interacción con los mecanismos de resistencia intrínsecos
• Autor: Francesc Xavier Mulet Aguiló
• Programa de doctorat: Microbiologia Ambiental i Biotecnologia
• Departament: Biologia
• Director: Antoni Oliver Palomo 

Data de publicació: 13/02/2015